O uso de mRNA em biologia
Em 1953, depois que Watson e Crick propuseram o modelo da dupla hélice do DNA , uma nova questão surgiu na comunidade científica: como a informação é codificada pelo DNA e como ela é traduzida? A primeira hipótese do envolvimento do RNA veio de André Boivin. Ele expressou sua ideia em um artigo publicado na Experientia, afirmando que “os ácidos desoxirribonucleicos macromoleculares governam a construção de ácidos ribonucleicos macromoleculares e, por sua vez, controlam a produção de enzimas citoplasmáticas”. No entanto, em meados da década de 1950, não havia conhecimento suficiente para apoiar essa hipótese (Cobb, 2015).
Descoberta do mRNA: Começou em 1961, quando Brenner e colegas descreveram a presença de uma molécula intermediária instável que copia a informação codificada pelo DNA e direciona a síntese de proteínas: o RNA. O grupo em torno de Brenner trabalhou com células infectadas por vírus e analisou a expressão do gene. Eles concluíram que a informação que codifica a proteína não está presente no RNA ribossômico estável. Em vez disso, uma molécula transitória de RNA atua como uma transcrição do código genético. Este RNA foi denominado RNA mensageiro (mRNA). Os ribossomos sintetizam as proteínas de acordo com as informações ditadas pelo mRNA (Brenner et al., 1961).
Os ácidos nucleicos podem induzir a produção de interferon: Em 1963, Isaacs et al. demonstraram que os ácidos nucleicos virais podem induzir a produção de interferon em células infectadas de galinha, coelho e camundongo. A produção de interferon suporta o fato de que o ácido nucléico é considerado estranho à célula (Isaacs et al., 1963).
Tradução de mRNA in vitro: Em 1969, o mRNA foi traduzido em laboratório pela primeira vez. Lockard e Lingrel, que trabalharam juntos na Universidade de Cincinnati, Ohio, forneceram a primeira evidência de tradução in vitro de mRNA. Eles usaram um sistema sem células de mamífero (coelho) para demonstrar a tradução de um transcrito de mRNA de outra espécie de mamífero (Lockard e Lingrel, 1969).
SP6 e T7 RNA polimerase: Além disso, em 1984, trabalhos experimentais mostraram que qualquer cDNA desejado pode ser utilizado para a síntese de mRNAs funcionais e, consequentemente, a síntese de proteínas (Krieg e Melton, 1984). À luz deste trabalho, a SP6 RNA polimerase acabou sendo comercializada. Além da polimerase SP6, os pesquisadores extraíram e purificaram a polimerase T7 RNA. Em 1985, eles também projetaram um complexo promotor da polimerase T7 para a expressão controlada de genes específicos que ainda é usado hoje (em forma atualizada) (Tabor & Richardson, 1985). Esses experimentos pioneiros levam a uma série imparável de trabalhos práticos relacionados à entrega e comercialização de mRNA.
Lipossomas como veículo de entrega de mRNA: Em 1978, os lipossomas foram utilizados para a entrega de mRNA a células eucarióticas (Dimitriadis, 1978). No final da década seguinte, um sistema de entrega de mRNA de lipossomas catiônicos, DOTMA, foi descrito e comercializado (Malone et al., 1989).
A ascensão: mRNA como agente terapêutico
Expressão de mRNA in vivo: A base do conceito de mRNA como um agente terapêutico foi lançada por Wolff J. e colegas em 1990. A equipe injetou RNA nu em músculos de camundongos para fornecer prova do princípio da transferência direta de genes in vivo (Wolff et al., 1990).
1º uso de mRNA como molécula terapêutica: Em 1992, uma equipe de cientistas trabalhando no Scripps Research Institute usou mRNA para reverter temporariamente o diabetes insípido em ratos Brattleboro que não produzem o hormônio vasopressina (Jirikowski et al., 1992).
1º uso de mRNA como vacinas: Embora o conceito de vacinas de mRNA pareça relativamente avançado, ele remonta a 1995, quando Robert e sua equipe projetaram a primeira vacina de mRNA que codificava antígenos de câncer (Conry et al., 1995).
1ª empresa de mRNA: todo esse trabalho na terapêutica de mRNA lançou a pedra fundamental da primeira empresa de mRNA já fundada: Merix Bioscience (1997) . Em 2004, a empresa mudou seu nome para Argos Therapeutics como sinal de sua evolução.
O clímax: desafios x soluções
A ideia de usar mRNA como agente terapêutico parece simples, mas não é. Dois grandes desafios tiveram que ser superados: 1) entrega bem-sucedida de mRNA e 2) prevenção de uma resposta imune contra a molécula de mRNA.
O isolamento do RNA é difícil, pois a RNase sempre presente degrada facilmente o RNA. Para evitar esta degradação, diferentes medidas para inibir a função RNase devem ser tomadas quando o RNA é isolado de células/tecidos.
Melhorando a estabilidade do mRNA: Quando o mRNA é injetado no corpo, ele desencadeia uma resposta imune. Como resultado, o mRNA injetado é degradado e a síntese das proteínas desejadas é interrompida.
Por essas razões, pouco financiamento foi concedido a estudos com foco em terapêutica baseada em mRNA. Até o Prêmio Nobel Philip A. Sharp achou que era um conceito com pouca praticidade pelas razões acima mencionadas. Katalin Karikó, pesquisadora da Universidade da Pensilvânia, lutou para conseguir fundos para sua pesquisa sobre a aplicação do mRNA. “Pensei em ir para outro lugar, ou fazer outra coisa”, disse Karikó. “Eu também pensei que talvez eu não fosse bom o suficiente, não fosse inteligente o suficiente. Tentei imaginar: está tudo aqui e só preciso fazer experimentos melhores.” Mesmo depois de todos os contratempos, ela continuou sua busca por aquele experimento melhor (Leah Asmelash e AJ Willingham, 2020).
Em 2015, Katalin Karikó e seu colega Drew Weissmann encontraram a solução para prevenir a ativação da resposta imune contra o mRNA injetado. Verificou-se que o mRNA ativa os receptores toll-like (TLR) nas células imunes. Karikó e Weissman modificaram o RNA inserindo um nucleosídeo modificado de ocorrência natural: a pseudouridina. Este transcrito de RNA modificado não ativa a resposta imune mediada por TLR e ainda fornece uma maior capacidade de tradução (Karikó et al., 2005). Um marco para a terapêutica baseada em mRNA foi alcançado. Até Sharp, o ex-crítico, acabou por dizer sobre o trabalho feito na Moderna: “Eles convenceram-me totalmente que é possível fazer”.
Melhorando a distribuição de RNA: Paralelamente, Pieter Cullis, da University of British Columbia, estudava lipídios. Em 1995, Cullis e sua equipe começaram a trabalhar na aplicação de nanopartículas lipídicas (lipossomas) para a entrega de grandes moléculas biológicas como o RNA. Mesmo que o sistema não funcionasse consistentemente, seu trabalho avançou na pesquisa sobre o uso de lipídios como um sistema de entrega eficaz e seguro (Bailey & Cullis, 1997).
Derrick Rossi, que trabalha na Harvard Medical School, baseou-se no trabalho de Shinya Yamanaka de induzir pluripotência e usou RNA para criar células-tronco embrionárias a partir de células adultas (Warren et al., 2010). Isso acabou levando à fundação da Moderna em 2010. No mesmo ano, Cullis, Karikó e Weissman colaboraram para formular uma vacina composta por mRNA e nanopartículas lipídicas. Até mesmo Sharp, o ex-crítico, acabou falando sobre o trabalho feito na Moderna: “Eles me convenceram totalmente de que é possível fazer.”
Transcrição in vitro de mRNA: Os ácidos nucleicos revolucionaram o campo da genética e da medicina regenerativa. A transcrição in vitro de mRNA abordou quase todos os desafios associados ao uso de mRNA como agente terapêutico. A transcrição in vitro é simples, rápida e controlada. Mais importante ainda, as modificações químicas podem ser introduzidas na cadeia de mRNA in vitro (Kwon et al., 2018).
Aplicações da tecnologia de mRNA
Durante os anos seguintes, vários ensaios pré-clínicos e clínicos sobre vacinas baseadas em mRNA contra doenças infecciosas, hipersensibilidades e câncer foram concluídos (Sahin et al., 2014; Weissman, 2015).
Vacinas
Em 2009, os pesquisadores conduziram o primeiro teste de imunoterapia contra o câncer usando vacinas baseadas em mRNA em seres humanos com melanoma metastático. Os resultados do ensaio mostraram um aumento no número de células T direcionadas à vacina contra o melanoma (Weide et al., 2009).
Em 2020, o FDA aprovou as primeiras vacinas baseadas em mRNA contra uma doença infecciosa SARS-CoV-2. Isso só foi possível graças a décadas de pesquisa sobre terapias baseadas em mRNA.
Medicina regenerativa
O mRNA não foi apenas um assunto de interesse para o desenvolvimento de vacinas, mas também influenciou outros campos, incluindo a ciência das células-tronco e as terapias de reposição de proteínas. Células-tronco pluripotentes induzidas (IPSCs)são uma adição altamente interessante à caixa de ferramentas da medicina regenerativa, pois as IPSCs podem se diferenciar em todos os outros tipos de células do corpo. O cientista japonês Shinya Yamanaka transfectou células somáticas introduzindo vários fatores de transcrição e as converteu em um estado de célula-tronco embrionária. Esse é o sonho da medicina regenerativa. No entanto, esse processo tem o perigo herdado de integração do DNA em locais aleatórios do genoma e, portanto, potencialmente levando a mutações adversas e resultados imprevisíveis. Para neutralizar esse problema, Yakubov et al. fibroblastos reprogramados (um tipo de células da pele) em IPSCs usando transfecção de mRNA. Este método evita completamente a integração do DNA e pode ser desenvolvido para substituir os métodos já disponíveis para gerar IPSCs (Yakubov et al., 2010).
Terapias de reposição de proteínas
Fundamentalmente, a terapêutica com mRNA pode ser considerada como uma forma transitória de terapia gênica que contorna as complicações da terapia gênica “convencional” em que o DNA é inserido no genoma, incluindo mutagênese insercional e toxicidade associada a vetores virais. Atualmente, os pesquisadores estão trabalhando na introdução de terapias de substituição de proteínas baseadas em mRNA para o tratamento de infarto do miocárdio (ataque cardíaco) (Weissman, 2015).
Engenharia genética
Em 2012, as equipes lideradas por Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier publicaram artigos de forma independente mostrando como o poder do CRISPR pode ser aproveitado para editar o genoma. Em geral, o sistema é composto pela enzima Cas9 e um RNA guia de fita simples (sgRNA) que são entregues à célula por meio de um plasmídeo ou vetor viral. Verificou-se que os vetores são relativamente estáveis e podem persistir na célula. A atividade fora do alvo do sistema CRISPR/Cas, no entanto, é parcialmente atribuída à persistência sustentada do DNA plasmidial que codifica Cas9 nas células.
A tecnologia de mRNA pode resolver essa limitação e fornecer mais benefícios. sgRNA e Cas9 mRNA podem ser co-entregues às células. Esta abordagem tem várias vantagens.
Em primeiro lugar, o mRNA é expresso transitoriamente, o que limita a probabilidade de atividade fora do alvo.
Em segundo lugar, o mRNA é traduzido diretamente no citoplasma. Em contraste, o DNA do plasmídeo precisa atravessar o envelope nuclear para permitir a transcrição, pois o DNA do plasmídeo depende da transcrição do hospedeiro e da maquinaria de tradução para expressar Cas9. O uso de mRNA ignora esta etapa, resultando em um início mais rápido da edição do gene.
Em terceiro lugar, como o RNA guia e o mRNA Cas9 são de fita simples, eles podem ser encapsulados em uma única nanopartícula, garantindo a entrega de ambos os componentes nas células-alvo. Portanto, a plataforma de mRNA pode abordar as limitações das abordagens de edição de genes (Xiong et al., 2018).
Anticorpoterapia
Anticorpos são as moléculas sob medida produzidas pelas células imunes para combater patógenos. Os anticorpos podem ser injetados no corpo de uma pessoa como um antídoto para uma toxina ou para eliminar infecções. Os anticorpos são compostos por quatro cadeias: duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Essas cadeias peptídicas são modificadas e ligadas por pontes dissulfeto.
Para a produção de anticorpos, são necessárias células eucarióticas, pois as células procarióticas não podem glicosilar as cadeias peptídicas. Este método de produção, no entanto, é muito caro. Para permitir a expressão econômica, alguns pesquisadores produziram fragmentos de anticorpo variável de cadeia única em E. coli . Esses fragmentos preservaram as características essenciais dos anticorpos. Infelizmente, sua meia-vida sérica é muito curta.
O mRNA do anticorpo pode ser uma alternativa muito mais adequada e econômica. Ele pode ser modificado facilmente e transportado diretamente para as células do paciente. Os anticorpos são então produzidos enquanto o mRNA autoamplificador estiver presente no organismo, proporcionando a expressão a longo prazo (até 6 semanas) de anticorpos específicos (Brito et al., 2014).
1. Anticorpos que codificam mRNA contra toxinas: Anticorpos são administrados em pessoas expostas a venenos (de cobras e aranhas, por exemplo) ou toxinas (difteria, botulínica). Sem tratamento, o corpo leva vários dias ou até semanas para produzir anticorpos. No entanto, no caso de veneno ou toxina, uma resposta imediata de neutralização é fundamental. Os anticorpos que neutralizam as toxinas são produzidos usando culturas de células de mamíferos; um sistema muito caro e menos acessível. A tecnologia de mRNA pode facilitar a produção direta de anticorpos e a administração por via intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intranodal permite uma resposta rápida. A neutralização mediada por mRNA pode ser uma alternativa de ação rápida ao uso de anticorpos (Schlake et al., 2019).
Uma vez que o mRNA precisa ser captado e expresso pelas células imunes imediatamente, muita atenção tem sido dada ao tipo de vacina de mRNA usada, via de administração e formato de entrega (nua, mediada por carreador, baseada em células). Lindsay e sua equipe, trabalhando na Georgia Tech e na Emory University, rastrearam o movimento da vacina mRNA in vivo. Eles relataram que o primeiro sinal forte de mRNA no linfonodo foi observado após 4 horas como resultado da administração intramuscular (Lindsay et al., 2019).
2. mRNA que codifica anticorpos contra doenças infecciosas:No passado, os anticorpos eram produzidos desafiando os cavalos com um patógeno e, em seguida, coletando seu soro contendo anticorpos (anticorpos policlonais). Essa abordagem tem sido utilizada para tratar vírus sincicial respiratório, hepatite A, hepatite B, citomegalovírus e sarampo. No entanto, em alguns pacientes, os soros equinos (soros derivados de cavalos) podem causar uma reação de hipersensibilidade. Na busca por sistemas de produção de anticorpos mais eficientes, muito trabalho se concentrou na produção de anticorpos monoclonais (mAbs) na década de 1990. mAbs são uma estratégia de imunização brilhante; são altamente específicos contra antígenos e podem ser produzidos em quantidades ilimitadas sem variação entre diferentes lotes. Além disso, nenhum animal está envolvido na produção de mAbs. No entanto, o desenvolvimento e fabricação de mAbs é caro, e um título muito alto de anticorpos é necessário para tratar ou proteger contra doenças infecciosas. Uma nova estratégia inclui a administração de mRNA que codifica mAb. Progressos significativos foram feitos em relação à eficácia do anticorpo que codifica mRNA contra HIV e raiva (Pardi et al., 2017; Thran et al., 2017; Schlake et al., 2019).
3. mRNA que codifica anticorpos contra tumores:Os mAbs podem identificar e matar células cancerígenas diretamente ou ativando células imunológicas para combater o câncer. Além disso, alguns anticorpos são específicos para células T e células cancerígenas, conhecidos como anticorpos biespecíficos. Eles aproximam as células T e as células cancerígenas e induzem as células T a matar as células cancerígenas. Vacinas baseadas em mRNA para câncer colorretal, câncer de próstata, câncer de mama triplo negativo, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, carcinoma escamoso de esôfago, adenocarcinoma gástrico, melanoma e carcinoma de pulmão de células não pequenas estão atualmente em ensaios clínicos (Miao et al., 2021 ). No entanto, existem algumas limitações de aplicação de mAbs. Possuem meia-vida sérica curta, principalmente anticorpos biespecíficos. Além disso, existem problemas de fabricação, incluindo estabilidade reduzida e uma tendência de agregação dos mAbs. As impurezas também podem se acumular durante o processo de produção. Todas essas limitações podem ser abordadas pela aplicação direta da codificação de mRNA para mAbs (Stadler et al., 2017; Schlake et al., 2019).
Trazendo mudanças pós-transcricionais com interferência de RNA
Outra classe de RNA de ocorrência natural chamada RNA de pequena interferência (siRNA) ou micro RNA (miRNA) foi descoberta em 1998 (MK e Kostas, 1998). Eles fazem parte da maquinaria pós-transcricional na célula. Em princípio, siRNA e miRNA têm como alvo mRNAs específicos para formar moléculas de RNA de fita dupla que são rapidamente degradadas (silenciamento de genes). Desta forma, a expressão gênica em uma célula pode ser controlada em um nível pós-transcricional. Essa abordagem é usada para desenvolver tratamentos para HIV, câncer e melanoma. Além disso, em 2018, a FDA aprovou a terapêutica baseada em mRNA contra a amiloidose ATTR hereditária (DeWeerdt, 2019).
O que o RNA nos reserva no futuro?
O sonho fascinante da terapêutica de RNA fez a transição para a realidade prática. No futuro, o RNA tem o potencial de interromper o campo da biofarmacêutica, desenvolvimento de vacinas, reprogramação celular, interferência de RNA e muito mais. Leia mais sobre a direção do RNA no futuro em nosso artigo sobre o futuro das aplicações de mRNA.
Fonte da história: Eurogenomics – Por Tamseel Fatima e Dr. Andreas Ebertz
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